熒光顯微鏡原理熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像

　　(一)光源

　　現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。

　　超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。

　　新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時(shí)間后，則需要高壓啟動(dòng)(約為15000V)，啟動(dòng)后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動(dòng)一次工作時(shí)間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強(qiáng)烈，因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作。

　　超高壓汞燈(100W或200W)光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。

　　國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡，平均壽命在200h以上，價(jià)格也比較低。

　　我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用(自帶直流電源)，易于攜帶，使用方便，已推廣應(yīng)用。

　　(二)濾色系統(tǒng)

　　濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號(hào)，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn)。如德國產(chǎn)品(Schott)BG12，就是種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的第一個(gè)字母，G是玻璃的第一個(gè)字母;我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾板名為QB24，Q是青色(藍(lán)色)拼音的第一個(gè)字母，B是玻璃拼音的第一個(gè)字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530，就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數(shù)字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當(dāng)于BG12。

　　1.激發(fā)濾板根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長范圍的激發(fā)光。

　　紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號(hào)為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。

　　紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。

　　紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號(hào)為QB24(BG12)。

　　最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達(dá)明色素)可用藍(lán)綠濾板(如B-7)激發(fā)。

　　近年開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對(duì)性強(qiáng)，波長適當(dāng)，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板，均遠(yuǎn)比玻璃濾板效果好。

　　激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準(zhǔn)。

　　2.壓制濾板壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過，提供相應(yīng)濾長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對(duì)應(yīng)，常用以下3種壓制濾板：

　　紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

　　紫藍(lán)光壓制濾板：能通過510nm以上濾長的熒光(綠到紅)，能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

　　紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的熒光(藍(lán)到紅)，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK490，K510。

　　(三)反光鏡

　　反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因?yàn)殇X對(duì)紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少，反射達(dá)90%以上，而銀的反射只有70%;一般使用平面反光鏡。

　　(四)聚光鏡

　　專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。

　　1.明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強(qiáng)，使用方便，特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。

　　2.暗視野聚光器暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無色濾板(不透過紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。

　　3.相差熒光聚光器相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。

　　(五)物鏡

　　各種物鏡均可應(yīng)用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能(波長范圍)適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大時(shí)其影響非常明顯。因此對(duì)熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡(4×,5×，6.3×等)。

　　(六)目鏡

　　在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。

　　(七)落射光裝置

　　新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后，波長短的部分(紫外和紫藍(lán))由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當(dāng)濾鏡對(duì)向光源呈45。傾斜時(shí)，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標(biāo)本，使標(biāo)本受到激發(fā)，這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí)，濾長長的部分(綠、黃、紅等)，對(duì)濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標(biāo)本的熒光處在可見光長波區(qū)，可透過濾鏡而到達(dá)目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高，在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標(biāo)本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。

　　二、熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求

　　(一)載玻片

　　載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。

　　(二)蓋玻片

　　蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。

　　(三)標(biāo)本

　　組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。

　　(四)封裱劑

　　封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

　　(五)鏡油

　　一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。

　　三、使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)

　　(1)嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。

　　(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。

　　(3)防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。

　　(4)檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，最多不得超過2～3h。

　　(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。

　　(6)標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。

　　(7)熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“一”—無或可見微弱熒光。“ ”—僅能見明確可見的熒光。“ ”—可見有明亮的熒光。“ ”—可見耀眼的熒光。

　　四、熒光圖像的記錄方法

　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果，如用細(xì)胞分光光度計(jì)，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。

　　熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。標(biāo)本的制作方法樣品須經(jīng)過石蠟包埋切片，然后用鐵礬蘇木精染色，普通光鏡觀察效果還可以.

　　作熒光觀察需用熒光染料DAPI染色，

　　石蠟切片的過程：

　　1.取材:刀片要求鋒利而薄,組織厚度約2—3mm,大小1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜.取材時(shí)間越快越好.

　　2.固定:組織取下后應(yīng)立即放入10%福爾馬林(相當(dāng)于4%甲醛)固定.

　　注意:(1).固定液量應(yīng)為組織塊體積的40倍.

　　(2)固定時(shí)間固定時(shí)間與使用的固定液種類和組織塊大小,溫度等有關(guān).一般為3—24h.

　　(3)固定溫度大多可在室溫固定,在低溫(4℃)時(shí)間應(yīng)延長.

　　(4)固定容器應(yīng)大些.

　　3.漂洗:流水沖洗2—10h.

　　4.脫水:從低濃度酒精到高濃度酒精.

　　70%(數(shù)分鐘)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(60-120’).

　　5.透明:組織塊脫水后必須經(jīng)過一種既能與酒精混合又能溶解石蠟的溶劑,而使石蠟進(jìn)入組織塊.常用二甲苯,一般浸泡30m即可.

　　6.浸蠟:組織經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱浸蠟.一般需經(jīng)2—3次浸漬才能完成,總時(shí)間為3—4h.用于浸蠟的石蠟熔點(diǎn)為52—56℃.

　　7.包埋:先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入.包埋面必須平整.包埋后石蠟稍凝后可移入冷水或冰箱中加速凝固.

　　8.切片:修塊→切片→展片→撈片→烤片.

　　也可作冰凍切片.

　　熒光染料的配制：

　　儲(chǔ)藏液：1mg/mldapi(DMSO、去離子水、pbs都可以溶解)

　　工作液：通常1μg/ml

　　染色時(shí)須避光，10min左右

　　用pbs沖去多余染液即可觀察。